IPS诱导肠类器官的培养过程分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化以及中后肠的模式化诱导和类器官的培养。本文将专注于第三个阶段——类器官培养，培养周期为14至28天。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需要准备以下试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）
• 基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）
• 15ml离心管（abs7102）
• 15ml EP管若干（abs7119）
• 24孔细胞培养板（abs7035）
• 金属冰盒

培养基成分

• 类器官培养基 A: 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B: 250ml
• 类器官传代消化液 D: 30ml
• 组织保存液 E: 100ml
• 类器官冻存液 F: 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G: 250ml

二、操作流程

1. 加胶、点板和加液

整个原代操作过程中，加胶和点板是关键步骤：

1. 准备工作：
   • 基质胶需在金属冰盒中于4℃冰箱中过夜融化。
   • 枪头和离心管需在-20℃下预冷至少半小时。
   • 融化后的基质胶可在4℃下保存，建议在2周内用完。
2. 接种要求：在24孔板每孔加入25μl基质胶和500-750μl类器官培养基。
3. 接种密度建议：基质胶总体积与球状体总体积的比例为25:1，或者每25μl基质胶添加50个球状体。
4. 混匀：将基质胶加入细胞团沉淀中，轻轻吹打混匀，并进行点板操作。
5. 成胶和培养：在37℃培养箱中放置40-60分钟后，添加培养基进行培养，通常10-14天后，类器官直径可达200-500μm，便可进行传代操作。

2. 传代操作

若类器官数量较多或体积较大，传代步骤如下：

1. 类器官收集及洗涤：
   • 移液器吸去培养基，添加4℃类器官传代培养缓冲液G。
   • 轻柔吹散基质胶并收集于15ml离心管中。
   • 洗涤后静置于4℃或-20℃以软化基质胶，然后进行离心操作。
2. 类器官消化：
   • 添加类器官传代消化液，消化2-3分钟，注意控制消化程度。
   • 终止消化并进行离心。
3. 再次加胶、点板及加液，确保操作在冰上进行，保持基质胶的良好流动性。

3. 冻存

在类器官处于指数增长期进行冻存，通常在传代后的第3至第4天，类器官直径应在100-200μm之间：

1. 类器官收集和洗涤。
2. 加入类器官冻存液，轻柔吹打重悬后立即进行冻存。
3. 采用梯度冻存，防止DMSO对类器官造成损伤。

四、复苏

复苏类器官时，需遵循严格的步骤以确保活性：

1. 将冻存管迅速解冻，并处理外部消毒。
2. 转移冻存液至离心管中，添加缓冲液并轻柔混匀后进行离心。
3. 加胶、点板和加液，再次在37℃培养箱中进行培养。

关键注意事项

• 确保Matrigel操作全程在冰上进行。
• 控制细胞密度，以便于增强球状体形成。
• 使用新鲜的生长因子，避免反复冻融。
• 保持无菌操作，以防污染。

通过严格遵循上述步骤并优化细节，可以高效生成功能性人类肠道类器官，为疾病建模和药物筛选等研究提供有力支持。若有任何实验相关问题，再次欢迎与我们交流！与ag尊龙凯时一同迈向生物医学的前沿。